一、细胞培养条件

细胞名称：人胰腺癌细胞HPAFⅡ

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液

培养体系：MEM + 10% FBS + 1% 丙酮酸钠 + 1% L-谷氨酰胺 + 1% P/S

贴壁传代方法：首次建议1:2传代，传代情况每2天更换培养基。备注：用无菌离心管收集瓶中培养基以作对比培养，如果对比效果不理想，建议直接使用尊龙凯时的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

为确保运输细胞的最佳状态，收到细胞后应立即将其培养至良好状态，并灌满完全培养液，封闭瓶口。收到细胞后，用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，随后在超净台内进行严格的无菌操作。细胞瓶应放置于37℃、5% CO2培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行处理。观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片保存（建议分别为40x, 100x, 200x各一张），前三天的照片为重要的售后依据。未提供照片的默认细胞状态良好。传代后，建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基进行对比培养，并在换液后将瓶盖稍微松开。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

若细胞汇合度未超过80%，将完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基，放入37℃、5% CO2培养箱中培养。若细胞密度超过80%，可进行传代，具体步骤如下：

弃去培养上清，用无钙、镁离子的PBS冲洗细胞1-2次。
添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，放置于37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞状态；若细胞变圆并脱落，迅速回到操作台，轻敲几下，然后添加5ml以上完全培养基以终止消化。
轻轻吹打细胞，使之完全脱落后吸出，再将悬液转移至15ml离心管，在1000 RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存

当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液，用PBS洗涤细胞一次。
加入0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，倒置显微镜下观察，待细胞变圆后加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
弃去上清，沉淀细胞后加入1ml尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，若需转移至液氮罐，请在-80℃下保存24小时以上后再转移。

c. 细胞复苏

从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护面具），迅速放入37℃水浴中解冻，直至无结晶，然后用75%酒精擦拭冻存管外壁。
将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
弃去上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
第二天更换新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

在运输过程中，某些细胞可能会因贴壁性不牢固而出现脱落，这属于正常现象。如果脱落较多，可以将瓶中所有培养液收集至离心管，1000 RPM离心5分钟，收集上清以做对比培养，通过沉淀加入胰酶1-2ml，轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后添加5ml完全培养基以终止反应，再进行下次离心和重悬，最后按1:2比例进行分瓶传代，补充新的完全培养基。

五、售后条款

1）可重发的情况

如下问题可判定为重发：

运输途中如遇细胞丢失、瓶身破损或培养液严重漏液等问题。
如出现细胞污染，请在收到产品48小时内提供真实的实验结果，经核实后可重发。
常温运输的细胞经静置24小时或干冰运输的细胞复苏24小时后如有大多数细胞未存活（需提供清晰的细胞状态照片）。
在常温发货的细胞未开封情况下，若复苏后24小时内出现污染。
细胞活性问题应在收到产品7天内提出，并用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后予以重发。
在收到产品当天以及第2、3天内拍摄照片以备依据，未及时告知的视为产品合格。
在4-7天内如出现问题需提供收到细胞前3天照片、问题时照片及操作步骤，并与技术人员沟通，由其判定责任。

2）不予重发的情况

如下情况不予重发：

客户造成的细胞污染。
因客户不当操作造成的细胞状态不良。
非本库推荐的培养体系造成的细胞状态不良。
未提供细胞培养前3天照片的情况。
在细胞培养时进行其他干预的情况。
如在收到细胞2天内未告知问题。
具体情况将由双方协商处理。

请遵循以上步骤和说明，以确保您在使用尊龙凯时的人胰腺癌细胞HPAFⅡ时获得最佳的培养效果。