细胞冻存是一种在低温条件下保存细胞的方法，其目的在于长期维持细胞的活性与功能。这项技术对细胞系的长期保存、实验重复性、基因库构建以及细胞治疗的备份等方面至关重要。通过有效的冻存，可以降低细胞在传代过程中的遗传变异，避免因污染、环境变化或实验操作失误造成的细胞损失。最佳的冷冻时机是在细胞达到最佳生长状态时。

冷冻保护剂是细胞冻存过程中的关键成分。常用的冷冻保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂的主要功能是降低溶液冰点，减少冰晶的形成，以保护细胞免受机械损伤。DMSO是适用于大多数细胞类型的常用保护剂，但某些细胞可能对其敏感，此时可以使用甘油作为替代方案。

第1阶段 冷冻保存实验步骤

1. 在冷冻管上标注日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数和细胞类型（包括其他有用信息，如基因修改）。

2. 对于贴壁细胞，去除细胞培养基并用PBS清洗，添加适量胰蛋白酶覆盖细胞，并在37°C的培养箱中孵育约2分钟（具体时间根据细胞类型调整）。

3. 添加相等的培养基终止消化，用移液管轻轻吹打细胞，将贴壁细胞冲洗到50mL Falcon管中。

4. 对于悬浮培养细胞，直接转移所需体积的细胞到50mL Falcon管内。

5. 使用血细胞计数器计数细胞以确定活力，冷冻保存的细胞活力应至少为75%。

6. 在室温下以300× g离心5分钟。

7. 准备冷冻培养基（见表1），确保其均匀混合并加热至37°C。

8. 去除上清液。

9. 加入配制好的冻存培养基至所需细胞密度，哺乳动物细胞的浓度通常为1×10⁶/mL。细胞在冻存液中室温放置的时间不应超过10分钟。

10. 将1mL样品分装到冷冻管中，盖紧盖子。

11. 将冷冻管转移至室温的冷冻盒中，再放入-80°C冰箱。冷冻盒外周添加适量异丙醇，以确保温度以每分钟1°C的速度稳定下降。缓慢的冷冻过程（每分钟-1°C）有助于避免细胞内部冰晶的产生。

12. 约24小时后，从冷冻盒中取出冷冻管并转移至液氮中进行长期储存。冷冻细胞可以在液氮中保存数年，理想情况下不应在-80°C下长期保存，以免影响细胞活力。

第2阶段 解冻冷冻细胞系实验步骤

1. 从液氮储存器中取出冷冻管，快速放入37°C水浴中解冻约80%（不应在室温下解冻），整个过程不应超过1分钟。快速解冻有助于减少冷冻过程中对细胞的损害。

2. 使用移液器将冷冻管中的内容物转移到约10mL预热培养基的15mL Falcon管中。

3. 以300× g离心5分钟，弃去上清液，用适量培养基重悬细胞沉淀。

4. 将细胞悬液转移到培养容器中，然后放置于37°C培养箱中进行培养。

采用以上方法进行细胞冻存与解冻，对有效保持细胞活力与功能至关重要。像尊龙凯时这样的品牌致力于为生物医学研究提供高品质的细胞冻存解决方案，助力科研工作者在细胞生物研究领域取得更卓越的成就。