一、同源重组法质粒构建

同源重组法在基因功能研究、蛋白表达与纯化等领域被广泛应用。该方法涵盖了基因敲除、敲低及过表达等技术，用于探讨基因功能、表达调控机制以及其对细胞生理过程和表型的影响。通过优化启动子、核糖体结合位点等表达元件，并选择合适的宿主细胞，利用同源重组法构建表达载体，使目的蛋白在宿主细胞中大量表达，从而实现目的蛋白的高效表达与纯化。与传统的酶切法依赖限制性内切酶的特异性切割不同，同源重组法则基于DNA分子间的同源序列进行重组。以下将介绍同源重组法质粒构建的实验步骤。

二、流程图

三、材料与仪器

进行同源重组法质粒构建所需的材料包括：目的片段的cDNA、引物、载体、限制性内切酶、酶切缓冲液、LB培养基、含LB培养基的细菌培养皿、同源重组酶、高保真酶、感受态细胞DH5α、凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、EP管、离心管、移液枪及枪头等。

四、实验步骤

同源重组法构建质粒的步骤如下：

1. 选择适用的内切酶，依据目的片段的酶切位点，通过双酶切法将环状载体质粒切割成线性化载体，并用琼脂糖凝胶法回收酶切产物，回收步骤根据试剂盒的说明操作。
2. 利用PCR法扩增目的片段的序列，并用琼脂糖凝胶法回收扩增产物。
3. 将线性化的载体与扩增的片段按比例进行连接，37℃下反应30分钟或更长（1到2小时）。将连接好的重组质粒（10μl）转入克隆感受态细胞DH5α，轻轻混合后在冰上静置30分钟，然后进行42℃水浴热激90秒，并立即转至冰上冷却2到3分钟。
4. 加入500μl不含抗生素的LB液体培养基，在37℃下摇菌1小时，转速250rpm。
5. 将培养液以5000rpm离心5分钟，弃掉300μl上清液，用剩余的培养基重悬细菌，推荐按不同梯度涂布，以防单克隆菌过密或过疏，然后用无菌涂布棒在含有质粒抗性的平板上均匀涂布，置于37℃培养箱中培养10到12小时。
6. 过夜后，挑取单克隆菌，置于5ml含抗生素的LB液体培养基中继续培养10到12小时。
7. 使用质粒小提试剂盒提取菌液中的重组质粒，后用限制性内切酶进行消化，并进行琼脂糖电泳鉴定。
8. 此时，也可以从菌液中吸取部分样品进行菌液PCR，琼脂糖凝胶电泳查看条带大小，进一步确认重组质粒的正确性。
9. 将经过验证的菌液送往测序公司进行双向测序，待序列比对结果正确后，即表示重组质粒构建成功，可进行后续实验。

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