免疫组化（IHC）实验是一种用于检测组织或细胞中特定抗原的定位、定性和定量研究的关键技术。该实验的流程涵盖了多个重要步骤，从样本的准备到最终的显微镜观察。以下是详尽的IHC实验流程：

样本固定

目的：固定组织样本以保持其形态结构，同时防止细胞自溶，并保留抗原性。

操作：使用10%中性甲醛溶液（NBF）进行固定，理想时间为18-24小时。确保组织完全浸没在固定剂中，以避免机械损伤。固定后，组织块应切成15×15×0.5 cm³的大小，以便于后续处理。

包埋

目的：将组织嵌入石蜡中，以利于切片。

操作：采用梯度酒精（75%、85%、95%、100%）进行脱水，每次1小时。使用二甲苯作为透明剂，使组织透明，最后将组织浸入熔融的石蜡中直至冷却固化。

切片

目的：将包埋的组织切成薄片，以方便观察。

操作：利用切片机调节刀片速度和锋利度，确保切片厚度为3-5μm。裁切后将切片附在载玻片上，并通过温水展开以防止折叠。

脱蜡与水化

目的：去除石蜡切片中的石蜡，以恢复水分状态。

操作：将切片在60°C烤箱中干燥30-60分钟。依次用二甲苯、梯度酒精（100%、95%、85%、75%）和蒸馏水进行脱蜡和水化，最后用PBS缓冲液洗涤3次。

抗原修复

目的：修复被固定剂掩盖的抗原表位，增强抗体的结合能力。

操作：使用柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）或EDTA缓冲液（pH 9.0）进行热修复。修复方法可包括高压蒸汽修复（120°C，20分钟）或微波修复（37°C，10-30分钟）。完成后，使用PBS洗涤3次。

封闭非特异性结合

目的：减小抗体与非特异性蛋白结合，以降低背景染色。

操作：用山羊血清或其他封闭剂（如正常血清）覆盖切片15-30分钟，然后用PBS洗涤3次。

一抗孵育

目的：一抗与目标抗原结合。

操作：按抗体说明书稀释一抗，并滴加至切片上。孵育条件为4°C过夜或37°C孵育1-2小时，孵育后用PBS洗涤3次。

二抗孵育

目的：二抗与一抗结合，形成抗原-抗体复合物。

操作：加入二抗工作液并孵育30-60分钟，最后用PBS洗涤3次。

显色

目的：通过底物显色反应，检测抗原-抗体复合物。

操作：使用DAB显色液（含H2O2），在室温下显色1-5分钟，显色后立即用去离子水终止反应。

复染

目的：增强对比度，以便于观察细胞结构。

操作：使用苏木素染色1-2分钟，随后用盐酸酒精分化并用去离子水冲洗。

脱水与封片

目的：去除切片中的水分，确保保存和观察效果。

操作：依次采用梯度酒精（75%、95%、100%）进行脱水，最后用二甲苯透明化。滴加中性树胶封片，并盖上盖玻片以去除气泡。

结果观察

目的：在显微镜下观察染色结果，以判断抗原的存在与分布。

操作：使用光学显微镜观察切片，并记录染色结果。可借助图像分析软件（如ImageProPlus）进行半定量分析。

注意事项

对照设置：必须设立阳性对照和阴性对照，以确保实验结果的准确性。

试剂配制：须严格按照说明书配制试剂，以确保浓度和pH值准确。

环境控制：保持实验环境清洁，避免交叉污染。

温度控制：在实验过程中需注意温度的控制，特别是在抗原修复和显色步骤中。

通过以上流程，您可以更有效地进行免疫组化实验，确保在生物医疗研究中获得可靠的结果。选择尊龙凯时作为您的实验品牌，助力您的研究更上一层楼。